解放军医学杂志

作者：陈瑞婧,冯韬锦,程实,李上,于海宽,陈铭,李毅,尹鹏滨,张里程,唐佩福,

单位：1解放军医学院，北京 100853 2解放军总医院第四医学中心骨科医学部，北京 100048 3国家骨科与运动康复临床医学研究中心，北京 100048 4哈尔滨医科大学附属第二医院骨科，黑龙江哈尔滨 150086

关键词：三维立体培养,人脐带间充质干细胞,外泌体,成骨分化

基金：National Natural Science Foundation of China(81972115)；国家自然科学基金(81972115)；National Natural Science Foundation of China(82002330)；国家自然科学基金(82002330)

目的 比较三维立体（3D）培养与传统贴壁培养（2D）人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）来源的外泌体促进成骨细胞分化能力的差异，探索前者在促进骨形成相关治疗中应用的可能性。方法 将hUC-MSCs分为2D组与3D组分别进行培养，在普通光学显微镜下观察细胞的形态特征，同时应用钙黄绿素-AM/PI活死细胞双染法检测3D组细胞的活性；通过转录组测序筛选两组差异表达基因并进行GO富集分析。提取2D组与3D组细胞分泌的外泌体并分为2D外泌体（2D-Exo）组与3D外泌体（3D-Exo）组，通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting对外泌体进行表征。在体外应用2D-Exo及3D-Exo干预乳鼠颅骨成骨细胞并进行成骨诱导分化，通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色及RT-qPCR鉴定2D-Exo、3D-Exo对成骨分化能力的影响。结果 与2D组比较，3D组细胞大小均等，聚拢成球形生长；钙黄绿素-AM/PI活死细胞双染可见3D培养的hUC-MSCs具有较高活性；转录组测序结果显示，与2D组比较，3D组上调基因富集于骨矿化、软骨发育、细胞外基质的组成、成骨细胞分化、血管生成、细胞增殖的正向调控及基因表达的正向调控等通路，下调基因富集于细胞增殖的负向调控、细胞迁移的负向调控、细胞凋亡等通路。透射电子显微镜观察可见两组外泌体的直径均为100 nm左右，呈现外泌体典型的杯状形貌特征，且均表达外泌体相关标志蛋白CD9、CD63和CD81。乳鼠颅骨成骨细胞染色结果显示，与2D-Exo组比较，3D-Exo组茜素红着色的钙结节数量及碱性磷酸酶染色强度均明显升高；RT-qPCR检测结果显示，与2D-Exo组比较，3D-Exo组成骨分化相关基因Bglap、Runx2、Alp、Col1a1、Spp1 mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 3D培养的hUC-MSCs来源的外泌体可上调成骨相关基因Bglap、Runx2、Alp、Col1a1、Spp1的表达，相较于2D培养来源的外泌体具有更强的促成骨细胞分化的能力。

来源：2023年第4期

《解放军医学》期刊编辑部

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