解放军医学杂志

作者：杨嘉昕,夏僮,周驷杰,罗子国

单位：重庆医科大学生命科学研究院，重庆 400016

关键词：双氢青蒿素,前列腺癌,PC-3细胞,自噬

基金：Science and Technology Research Project of Chongqing(41021300060448)；重庆市科学技术研究项目(41021300060448)

目的 探讨双氢青蒿素（DHA）对前列腺癌PC-3细胞的自噬诱导作用及其机制。方法 用0、12.5、25、50、100 μmol/L DHA处理PC-3细胞，采用CCK-8法检测细胞活力，克隆形成实验检测细胞增殖能力。取PC-3细胞，设置对照组（不做处理）、DHA组（50 μmol/L DHA处理48 h）、自噬抑制剂3-MA组（5 mmol/L 3-MA处理48 h）、DHA+3-MA组（50 μmol/L DHA+5 mmol/L 3-MA处理48 h），采用Western blotting和RT-qPCR检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、酵母Atg6同源物（Beclin-1）]的表达情况，透射电镜观察自噬小体形成情况，使用自噬双标慢病毒mCherry-GFP-LC3B转染PC-3细胞检测自噬流变化，CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡率。设置对照组（不做处理）、DHA组（50 μmol/L DHA处理48 h）、ROS抑制剂NAC组（5 mmol/L NAC处理48 h）、DHA+NAC组（50 μmol/L DHA+5 mmol/L NAC处理48 h），采用Western blotting检测ROS/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达。用50 μmol/L DHA处理PC-3细胞48 h后提取总蛋白，分成Input组（全蛋白裂解液）、IP组（加入Beclin-1抗体）、IgG组（加入同等质量的IgG），采用免疫共沉淀（Co-IP）实验检测Beclin-1与Vps34、Bcl-2及HMGB1蛋白的相互作用。结果 CCK-8法检测结果显示，PC-3细胞存活率随着DHA浓度的升高而降低，且呈剂量和时间依赖性（P<0.05）；DHA作用24、48、72 h的半数抑制浓度（IC50）分别为97.12、57.10、29.35 μmol/L，据此选择50 μmol/L DHA作用48 h进行后续实验。克隆形成实验结果显示，PC-3细胞克隆形成率随着DHA浓度的升高而明显降低（P<0.01）。Western blotting和RT-qPCR检测结果显示，与对照组比较，DHA组PC-3细胞中Beclin-1、LC3B mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与DHA组比较，DHA+3-MA组PC-3细胞中Beclin-1、LC3B mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。透射电镜观察可见DHA组PC-3细胞中出现明显的自噬小体，且自噬小体数较对照组明显增多（P<0.05）。mCherry-GFP-LC3B慢病毒转染实验结果显示，与对照组比较，DHA组每细胞红黄斑点比增高（P<0.01），DHA+3-MA组每细胞红黄斑点比降低（P<0.01）。与DHA组比较，DHA+3-MA组细胞存活率降低，凋亡率增高（P<0.01）。与对照组比较，DHA组PC-3细胞中p-mTOR蛋白相对表达水平降低（P<0.05），p-AMPK蛋白相对表达水平升高（P<0.01）；与DHA组比较，DHA+NAC组p-mTOR蛋白相对表达水平升高（P<0.01），p-AMPK蛋白相对表达水平降低（P<0.01）。Co-IP实验结果显示，DHA处理后Beclin-1与Bcl-2的作用减弱，与Vps34、HMGB1的结合增强。结论 DHA可诱导前列腺癌PC-3细胞发生自噬，其机制可能与调控自噬相关基因Beclin-1、LC3及ROS/AMPK/mTOR信号通路有关。

来源：2023年第6期

《解放军医学》期刊编辑部

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